文献解读 - 肿瘤测序 - 第六期|《基于 CRISPR/Cas9 技术的肿瘤突变负荷测量新参考物质的开发》

关键词：肿瘤测序；基因组变异检测；

文献简介

• 标题（英文）：Development of a Novel Reference Material for Tumor Mutational Burden Measurement Based on CRISPR/Cas9 Technolog

• 标题（中文）：基于 CRISPR/Cas9 技术的肿瘤突变负荷测量新参考物质的开发

• 发表期刊：Cancer Genetics

• 作者单位：中国医学科学院老年医学研究所国家临床检验中心等

• 发表年份：2022

• 文章地址：https://doi.org/10.3389/fonc.2022.845636
  

图 1 文献介绍

作为影响免疫检查点抑制剂治疗决策的生物标志物，肿瘤突变负荷（TMB）估计的准确性、可靠性和可比性至关重要。该研究中，研究者开发了一组具有不同 TMB 值的福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）样品作为 TMB 估计的新参考材料。通过使用 CRISPR/Cas9 技术将几种临床相关变异引入人类细胞系，构建了几种典型的细胞系并进行了外显子测序验证。然后进行细胞混合和石蜡包埋，制备了新型 FFPE 样品。

测序流程

图 2 CRISPR/Cas9 系统生成与 MSH2 和 POLAR 变体共存的新细胞系

Figure 1Generation of novel cell lines co-existing withMSH2andPOLEvariants by CRISPR/Cas9 system.(A)Schematic of the two-stage strategy for generating novel cell lines co-existing withMSH2andPOLEvariant. The sequence of sgRNAs forMSH2C199R (sgRNA-MC) andMSH2P349R (sgRNA-MP) are marked in yellow and sequence of sgRNAs forPOLEP286R (sgRNA-PP) andPOLEV411L (sgRNA-PV) are marked in blue.(B)Sequences of the PCR products showing the correct mutations of positive clones. 4 differentMSH2mut/POLEwtcell lines and 6 differentMSH2mut/POLEmutcell lines were ultimately constructed.

该研究首先使用 CRISPR/Cas9 系统生成与 MSH2 和 POLAR 变体共存的新细胞系，然后利用 WES 测序对构建的编辑细胞突变和 TMB 进行了检测和验证；最后，基于 WES 测序结果将编辑细胞进行梯度比例混合，之后制备成 FFPE 样本，并对 FFPE 样本进行 WES 测序，验证了 FFPE 样本的 TMB 特征和样本的均质性。结果说明 FFPE 参考物质具有很好的可行性、均质性和稳定性。

图 3 Sentieon 的作用

在该研究中，Sentieon 被用于质控后续分析，包括参考序列比对、排序、局部重比对、去重复及 BQSR 等分析。

Sentieon 软件团队拥有丰富的软件开发及算法优化工程经验，致力于解决生物数据分析中的速度与准确度瓶颈，为来自于分子诊断、药物研发、临床医疗、人群队列、动植物等多个领域的合作伙伴提供高效精准的软件解决方案，共同推动基因技术的发展。截至 2023 年 3 月份，Sentieon 已经在全球范围内为 1300+用户提供服务，被世界一级影响因子刊物如 NEJM、Cell、Nature 等广泛引用，引用次数超过 700 篇。此外，Sentieon 连续数年摘得了 Precision FDA、Dream Challenges 等多个权威评比的桂冠，在业内获得广泛认可。

文献结论

图 4 文献结果

总结

总之，该研究基于 CRISPR/Cas9 系统将几种临床相关变异引入人类细胞系，构建了几种典型的细胞系并进行了外显子测序验证。然后进行细胞混合和石蜡包埋，制备了新型 FFPE 样品。经过验证，这些 FFPE 参考物质具有很好的均质性和稳定性。