文献解读 - 基因编辑 - 第十一期|《通过 CRISPR 介导的 Gaa 纯合 c.1935C>A(p.D645E) 点突变的庞贝氏病敲入小鼠模型的建立和表征模拟了……》

关键词：基因组变异检测；全基因组测序；基因编辑；

文献简介

• 标题（英文）：CRISPR-Mediated Generation and Characterization of a Gaa Homozygous c.1935C>A (p.D645E) Pompe Disease Knock-in Mouse Model Recapitulates Human Infantile Onset-Pompe Disease

• 标题（中文）：通过 CRISPR 介导的 Gaa 纯合 c.1935C>A(p.D645E)点突变的庞贝氏病敲入小鼠模型的建立和表征模拟了人类婴儿期发病的庞贝氏病

• 发表期刊：《bioRxiv》

• 作者单位：CHOC 儿童研究院等

• 发表年份：2022

• 文章地址：https://doi.org/10.1101/2022.05.30.494061
  

图 1 文献介绍

庞贝病 （PD） 是一种常染色体隐性遗传病，由溶酶体酸 α-葡萄糖苷酶 （GAA） 不足引起，导致溶酶体内糖原在组织中的降解减少和随后的积累，尤其是骨骼肌和心肌。c.1935C>A （p.Asp645Glu） 变异是台湾和华南地区人群中最常见的 GAA 致病突变，可引起婴儿期 PD （IOPD），新生儿表现为重度肥厚型心肌病、严重肌张力减退和呼吸衰竭，如果不治疗会导致夭折。

测序流程

图 2 GaaEm1935C>A 敲入小鼠的生成

为了后续研究 IOPD 致病机制及促进与该突变相关的治疗方法的开发，在本研究中，研究者使用一种新的双 sgRNA 方法在靶向位点两侧应用 CRISPR-Cas9 同源定向修复（HDR）产生了 GaaEm1935C>A 敲入突变小鼠模型以及携带 Gaac.1935C>A 突变的肌母细胞系。研究者对 3 月龄 GaaEm1935C>A 纯合突变小鼠的分子、生化、生理、组织学和行为特征等方面进行了详细描述。在全基因组数据分析部分，研究者使用 Sentieon 中的不同模块对测序数据进行 PCR 错误鉴定、去重复、InDel 附近 reads 重排、变异检测等。

图 3 Sentieon 的作用

Sentieon 软件团队拥有丰富的软件开发及算法优化工程经验，致力于解决生物数据分析中的速度与准确度瓶颈，为来自于分子诊断、药物研发、临床医疗、人群队列、动植物等多个领域的合作伙伴提供高效精准的软件解决方案，共同推动基因技术的发展。 截至 2023 年 3 月份，Sentieon 已经在全球范围内为 1300+用户提供服务，被世界一级影响因子刊物如 NEJM、Cell、Nature 等广泛引用，引用次数超过 700 篇。此外，Sentieon 连续数年摘得了 Precision FDA、Dream Challenges 等多个权威评比的桂冠，在业内获得广泛认可。

文献讨论

图 4 文献讨论

尽管除了 HET GAA 酶活性预期降低 50%外,c.1935C>A HET 和 WT 之间没有观察到表型差异,但纯合 KI 小鼠表现出显著的类似 PD 的表型。KI 小鼠的 Gaa mRNA 水平正常,但心脏、骨骼肌和脑组织中 GAA 水解活性显著降低,但仍有一定水平(约为 WT 的 1%)。这与先前在 c.1935C>A 纯合患者成纤维细胞中测量到的低 GAA 酶活性水平(正常对照范围的 0.08-0.82%)一致。KI 小鼠肌组织中观察到糖原贮积显著增加,与人类 GAA c.1935C>A IOPD 表型一致。值得注意的是,GaaEm.1935C>A 小鼠脑组织中的糖原贮积没有受到影响。心脏和骨骼肌组织中观察到自噬受损,与人类 PD 和其他小鼠 PD 模型中观察到的一致。

总结

综上所述，GaaEm1935C>A 敲入小鼠模型概括了由 Gaac.1935C>A 致病变异引起的人类 IOPD 的分子，生化，组织病理学和表型方面特征。它是评估治疗 IOPD 的创新疗法的理想模型，包括纠正致病变异，恢复 GAA 活性和产生功能表型的个性化治疗策略。